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中國農(nóng)科院利用LUYOR-3415進行瓜類的研究

更新時間:2022-05-30   點擊次數(shù):1048次

中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所近日在《Horticulture Research》發(fā)表了文獻為《Targeted creation of new mtants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants》。本文獻中采用了LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源來篩選GFP陽性的植株。

文獻摘要

葫蘆科的水果和蔬菜,如黃瓜、甜瓜、西瓜和南瓜,對人類飲食有很大貢獻?;蚪M編輯技術的廣泛使用極大地加速了基因功能表征和作物改良。然而,大多數(shù)經(jīng)濟上重要的葫蘆科植物,包括甜瓜和南瓜,仍然對標準的根癌農(nóng)桿菌介導的轉化具有抗拒性,從而限制了基因組編輯技術的有效使用。在本研究中,我們采用佳滲透強度"策略建立了的甜瓜和南瓜遺傳轉化系統(tǒng)。我們利用這種方法的力量來靶向ERECTA的同源物受體激酶基因家族,并創(chuàng)造了等位基因,導致甜瓜、南瓜和黃瓜中節(jié)間較短的緊湊植物結構。此處介紹的優(yōu)化轉化方法能夠實現(xiàn)穩(wěn)定的 CRISPR/Cas9 介導的誘變,并為葫蘆科作物的功能基因操作提供了堅實的基礎。

葫蘆科長期以來被認為是難轉化的作物之一,嚴重阻礙了基因組編輯工具的應用。在黃瓜和西瓜中已經(jīng)報道了成功的遺傳轉化和基因組編輯[ 13 , 14 ]。然而,黃瓜的轉化效率仍然很低,用于西瓜再生的間接器官發(fā)生目前與其他葫蘆科作物不兼容。因此,其他經(jīng)濟上重要的葫蘆科作物,如甜瓜和南瓜,仍然難以穩(wěn)定轉化,這極大地阻礙了功能基因組研究和快速產(chǎn)生賦予這些作物理想性狀的突變。

農(nóng)桿菌浸潤被認為是建立穩(wěn)定的遺傳轉化系統(tǒng)的關鍵。在器官發(fā)生過程中,不定芽從不同植物物種的原形成層或形成層細胞開始 [ 25 ],這些組成了農(nóng)桿菌感染的靶組織。然而,盡管以前的研究認識到需要感染外植體的更深細胞層,但尚未開發(fā)出統(tǒng)一的標準協(xié)議來實現(xiàn)這一目標。在實踐中,必須在感受態(tài)細胞的充分感染和整個外植體的過度感染之間取得良好的平衡,這會導致嚴重的損傷并降低轉化效率。

為了克服這些問題,我們采用了佳強度的浸潤策略來確定特定的一組條件,以確保血管組織中的形成層細胞*感染,同時對外植體造成盡可能小的損傷。在這里,我們確定了真空滲透、超聲處理和微刷的佳強度,以獲得良好的甜瓜和南瓜轉化效率,我們還在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑 LA,以保護外植體免受損傷。在這些優(yōu)化的條件下,維管組織感染有效,外植體損傷小,導致甜瓜和南瓜的穩(wěn)定遺傳轉化,效率約為4%。使用相同的策略,我們提高了不同黃瓜種質的轉化效率,并部分克服了基因型依賴性。

這種在葫蘆科作物中且穩(wěn)定的遺傳轉化系統(tǒng)使我們能夠在這些物種中進行 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯。擬南芥ER基因家族編碼富含亮氨酸的重復受體樣激酶,已被證明可調節(jié)莖伸長 [ 27 ]。編輯瓜類ER同源物在甜瓜、南瓜和黃瓜中產(chǎn)生了er突變體。所有突變體都具有較短的節(jié)間和矮化表型,這可能有利于改善植物結構和育種。


總之,我們提出了一種穩(wěn)定的甜瓜和南瓜遺傳轉化系統(tǒng),并證明 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯在這些葫蘆科作物中是有效的。這里描述的方法將大大加快對葫蘆科作物的研究,包括基礎植物生物學和優(yōu)良品系的創(chuàng)造。

植物材料和生長條件

本研究分析了十個甜瓜品種:P147(栽培甜瓜)、ivf105(栽培甜瓜) 、m1(栽培甜瓜)、m2(栽培甜瓜)、m3(栽培甜瓜)、m4(栽培甜瓜)、m5(野生甜瓜) , m6 (栽培甜瓜), m7 (栽培葡萄) 和景玉(商業(yè)雜交種),其中 ivf105 m1 m7 由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所(IVF)王懷松提供。本研究使用黃瓜自交系Cu2(華南型)、新太米刺(華北型)、404(華北型)和Eu1(歐洲型)的種子。兩種商業(yè)moschata材料,金心針4號和金心針11號,用于南瓜改造。在分化和生根階段將所有組織培養(yǎng)物保持在培養(yǎng)室中。生根后,將再生植物轉移到培養(yǎng)箱中約一周,然后在溫室中種植,光照條件為 16 小時光照/8 小時黑暗,溫度范圍為 18°C 24°C。

需要使種子發(fā)芽以獲得外植體,種子發(fā)芽的條件如下。將種子在 50°C 的溫蒸餾水中浸泡 30 分鐘,然后用鑷子去除種皮。種子用 75% 乙醇 15 秒和 1% 次氯酸鈉溶液 15 分鐘進行表面消毒,然后用無菌蒸餾水沖洗 6 次。瓜子、南瓜和黃瓜的滅菌種子在 28°C 下在含有 7.5 mL 滅菌水的培養(yǎng)皿上涂抹 1-2 天。在 28°C 下,僅將 Cu2 種子散布在含有 GM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。

sgRNA設計和質粒構建

sgRNA 是使用 CRISPR-GE 網(wǎng)絡工具 設計的。如前所述 [ 49 ] sgRNA 插入 pBSE402 載體。簡而言之,將含有 1.5 μL 100 μM 正向引物、1.5 μL 100 μM 反向引物、5 μL 10× NEB 緩沖液 3.1 42 μL 水的 50 μL 混合物在 95°C 下孵育 5 分鐘,然后升溫以 0.1°C/s 下降到 20°C,產(chǎn)生一個短的雙鏈 DNA 片段。使用限制酶Bsa I T4 連接酶 (New England Biolabs)將短 DNA 片段插入 pBSE402 。將構建的重組載體轉化農(nóng)桿菌菌株EHA105。引物顯示在表 S2。

檢測 GFP 熒光

為了篩選 GFP 陽性植物,在組織培養(yǎng)階段使用 Leica MZ10 F 立體顯微鏡(Leica MicrosystemsGermany)檢查再生一個月的外植體。在溫室中用LUYOR-3415RG激發(fā)光源(Luyor Instrument,上海)激發(fā)后觀察植物的綠色熒光蛋白GFP熒光。將不同感染強度處理的外植體在冰上沿橫向和縱向手工切片,在立體顯微鏡下立即觀察到有血管組織部分的GFP熒光。

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上圖為:(abcGFP強度,感染維管組織的外植體,以及五種不同處理下甜瓜m1的存活率,分別。數(shù)據(jù)是三個重復的平均值,誤差線表示標準偏差。不同的小寫字母表示差異顯著(p<0.05,Tukey 檢驗)。(d) 將再生的轉基因 T0 甜瓜植物轉移到土壤中。轉基因甜瓜 T0 植物的 GFP 熒光頂端分生組織 (e) 和種子 (f g)。LUYOR-3415RG GFP 通道下甜瓜的轉基因 T1 植物 (h) WT (i)。組織因 GFP 表達而呈綠色,因葉綠素自發(fā)熒光而呈紅色。


注:內容為谷歌翻譯,并非原作者翻譯

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